书不如思贵，意不可言传

CRISPR-CAS9技术的火热和应用前景无需多提，为了了解这个领域，我们梳理了下CRISPR的发展历程，做个学习和记录。有疏漏和不足之处，还请指正。

1987: 大肠杆菌中报道CRISPR重复序列 (当时还不叫CRISPR)。这是长29 bp，间隔32 bp的5个高度同源的序列组成。当时其它原核生物中未找到同源序列，重要性未知。(日本¹)

2002: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)术语用于描述细菌和古细菌中长度在21 ~ 37 bp，中间间隔相等大小非重复序列的重复序列簇。4个CRISPR相关的基因 (cas基因)因位于CRISPR位点临近而鉴定出来并因此命名，表明这两者之间存在功能关系。类似我们在用STRING寻找蛋白-蛋白互作网络中提到基于基因组位置的相关性。发现的cas4基因有RecB核酸外切功能域。 (荷兰 ²)

2005: CRISPR间隔序列发现与外源DNA匹配。CRISP在更多原核基因组发现，cas家族蛋白鉴定出7个。间隔序列发现与其它基因尤其是来自于噬菌体和其它染色体外元件的序列同源。S. thermophilus (嗜热链球菌)对噬菌体的敏感性与CRISPR位点出间隔序列的多少有关。作者认为间隔序列是对染色体外元件侵染的记录，通过编码反义RNA提供对噬菌体或外源DNA侵染的细胞免疫。(法国³)

2006: CRISPR首次提出可以作为细菌的适应性免疫系统。Koonin EV等把cas基因根据蛋白序列归类为25个不同的家族。比较基因组学分析把CRISP-Cas系统 (CAAS)对抗入侵的噬菌体和质粒类比与真核生物中的RNA干扰。虽然序列相差较大，但两个系统的同工酶有很好的对应关系。但作者认为这一系统在进化上是不稳定的，因为及其相近的原核生物直接序列都相差较大。(美国⁴)

2007: 比2005年的研究再进一步，证实了其推论。发现病毒侵染后细菌整合来自于噬菌体基因组的序列作为新的间隔序列。移除或增加特殊的间隔序列改变了细菌的噬菌体抗性。(美国⁵)

2009: CRISPR RNA-cas切割入侵RNA首次报导。该实验室还发现新进加入的间隔序列在细菌中转录丰度最高。(美国⁶)

2010: 与2007年的结论无异。(加拿大⁷)

2011: repeat/spacer来源的crRNA的前体重复序列互补的24-nt反式tracrRNA促进crRNA的成熟和发挥作用，对抗入侵者。 (瑞典⁸)

2012: 发现Cas9可以在crRNA与靶DNA互补配对结合的条件下作为内切酶诱导DNA双链断裂，提出RNA控制的基因组编辑。HNH功能域切割互补链，RuvC-样功能域切割非互补链。(美国⁹)

2013: 短RNA介导CRISPR/Cas9用于编辑人和小鼠细胞的基因。(美国¹⁰，华人张锋)。同年，CRISPR/Cas9应用于植物基因编辑。(美国¹¹，英国¹²)

2014: Cas9与guide RNA和target DNA复合体的晶体结构。5’-NGG-3’ protospacer adjacent motif (PAM) 依赖的靶DNA的解链和RNA-DNA复合体的形成。(日本¹³，瑞士¹⁴)。

2015: 在人三原核合子(移植前胚胎)中，应用CRISPR/Cas9有效编辑内源性beta-globin基因，并且发现脱靶现象。(中国¹⁵)

2016: CRISPR/Cas9编辑的作物不被认为是转基因作物，一是缺少外源DNA，二是不好区分。(Nature news¹⁶)

2016: NIH批准第一个CRISPR基因编辑临床试验，编辑T细胞治疗癌症。(Nature news¹⁷)

2017: 哺乳动物中CRISPR/Cas13编辑RNA (美国¹⁸)和不需要DNA切割的高敏感低脱靶腺嘌呤碱基编辑器 (adenine base editors, ABEs) (美国¹⁹)。这两个都是华人的工作，第二篇的作者David Liu入选2017年Nature十大人物。

2018: 人血清中发现Cas9蛋白抗体。最常用Cas9同源蛋白来自于金黄色葡萄球菌和化脓链球菌。这两种菌在人群中有较高的感染频率，79%的捐赠人和65%的捐赠人有金黄色葡萄球菌和化脓链球菌的抗体。 (美国²⁰)

https://timelines.issarice.com/wiki/Timeline_of_CRISPR

这只是比较粗浅的总结，还有很多重要的研究没有囊入。比如CRISPR/Cas9介导的基因激活、染色体修饰的改变等。

更多关于CRISPR/CAS9的总结和发展趋势还需要那些活跃在一线，真真正正做技术的牛人们来解答。但牛人太忙，偶尔见一面，也只是找我们寻求服务。现在有了一个他们向大家作报告的机会。

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